吹爆它！小鼠胚胎移植，采集、鉴定、案例展示，此文全了！

一、胚胎移植的概念

1、胚胎移植(embryo transfer，ET)

指将一只雌性动物的早期胚胎(或受精卵)取出，或者由体外受精及其他方式获得的胚胎(或受精卵)，移植到另一只同种生理状态相同的雌性动物的体内，使之继续发育成为新个体的技术，又称之为“人工受胎” 或“借腹怀胎”。其中提供胚胎的个体称为供体(donor)，接受胚胎的个体称为受体(recipient)。

2、胚胎移植程序

（1）供、受体的同步发情；

（2）供体的超数排卵和配种；

（3）胚胎的采集；

（4）胚胎的质量鉴定；

（5）胚胎的移植；

二、供体及受体的同步发情方法

同步发情 (estrus synchronization)是使供、受体动物在同一时期内同时发情、同期排卵的技术，是胚胎移植的前提，供、受体只有发情同期化，其生殖道的内环境才能一致，才能使移植的异体动物的胚胎着床。

同步发情的原理是通过外源激素的调节，控制供、受体的动物的发情排卵在同一时间发生。其策略有二：1是使黄体期缩短，2是使黄体期延长。

图注：A:自然发情周期；B:缩短黄体期(前列腺素F2a处理法) ；C:延长黄体期(孕激素处理法)

三、供、载体的超数排卵和配种法

在动物发情周期的适当时间，注射外源促性腺激素，使卵巢比自然发情时有更多的卵泡发育并排卵，这种方法称为超数排卵(superovulation)， 简称超排。动物卵巢上约有99%的有腔卵泡发生闭锁而退化，只有1%能发育成熟而排卵。

实验研究发现在动物的黄体期结束之后，卵泡期启动之前，注射促性腺激素，能使卵泡不发生闭锁而正常发育，在排卵之前再注射黄体生成素(LH)或人绒毛膜促性腺激素(HCG) 补充内源性的黄体生成素(LH)不足，可保证多数卵泡成熟、排卵。

对动物做超数排卵处理的常用激素有：孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡成熟激素(FSH)、黄体生成素(LH) 等。

1、经过超数排卵处理的动物发情后应适时配种；

2、由于超排时的生殖道环境与自然发情差异较大，为保证排出的卵子能及时受精，应使用活率高、密度大的精液，而且输精次数和每次输精的有效精子数至少要增加1倍。

图注：A（左）、B（右）：不同活率及密度的精液对比

供体：正常母鼠腹腔注射50μLPMSG，相隔48h后，再腹腔注射等量HGG，当日与正常雄鼠1:1合笼交配，次日检栓(阴道涂片观察)，见栓当日为妊娠第1日。

制备假孕母鼠：首先要获得结扎公鼠。将 6～8 周龄的公鼠，麻醉，腹部手术，将两侧的输管结扎，缝合，休息 4 周以上备用。在供体小鼠合笼后的12-24h内，将准备作受体的雌性小鼠与扎公鼠合笼(1:1)。第二天清晨检查阴栓，有阴道栓者为假孕母鼠。

图注：A：公鼠与母鼠合笼；B：阴道栓观察

四、胚胎的采集

胚胎采集又称冲卵、采胚，它是利用特定的溶液和装置将早期胚胎从母体的子宫或输卵管中冲出并回收利用的过程。胚胎的冲洗采用腹部切开的手术法。要根据实验的需求从不同的部位冲取不同发育阶段的胚胎。冲洗时要考虑配种时间、排卵时间、胚胎位置，才能得到较高的收集率。

图注：输卵管采胚法：一般是用带有磨钝针头的注射器刺入子宫角顶端，注入冲胚液，然后从输卵管的伞部接取冲胚液(上行法，图A（左）)，也可与之相反方向冲取(下行法，图B（右）)

图注：子宫角采胚法 ：按上图的方法对子宫角进行上行或下行法冲洗，采集胚胎。

五、胚胎的质量鉴定

胚胎的鉴定是指应用各种手段对胚胎质量和活力进行评定或等级分类。生产中常用形态学方法进行胚胎的级别鉴定，就是将体视镜的放大倍数调至 80～100倍，通过观察胚胎的形态、卵裂球大小与均匀度、色泽、细胞密度、与透明带间隙以及细胞变性等情况，将胚胎进行质量分级。

在国内，胚胎按质量的高低被分为 A、 B、 C和D四级，与国际上的1、2、3和4级相应，具体标准见下表。正常发育的胚胎，其中卵裂球一般外形整齐清晰，大小一致，分布匀而紧密，发育速度与胚胎日龄相一致。对发育正常的胚胎供移植或体外培养和保存。胚胎质量和活力鉴定除了形态学方法外，还有体外培养法、荧光法(活体染色法)、测定代谢活性和胚胎的细胞计数。

图注：不同发育阶段的早期胚胎以及异常卵的形态

六、胚胎移植

1、移入路径

（1）不加培养的胚胎：

从输卵管冲出的胚胎应移入受体的输卵管内；

从子宫角冲出的胚胎应移入受体的子宫角内。

（2）经过培养的胚胎：

体外生产的胚胎，则要根据胚胎发育的阶段，移入相应的部位。

2、数量

（1）单胎动物：

移入1～2枚合格的胚胎即可；

（2）多胎动物：

至少要移入4 枚以上的胚胎，才能产生足够的妊娠信号，使胚胎着床(实验动物一般为多胎动物)

3、手法

各种动物的生理特点不同，胚胎移植的操作也有差异。

图注：手术法将胚胎移入输卵管

图注：手术法将胚胎移入子宫角

七、实验步骤

1、实验鼠适应性饲养1周。术前禁食12 h(不禁水)。将实验鼠放进连接好的麻醉机诱导箱，调整异氟烷浓度至5%，完成诱导麻醉后将实验鼠仰卧位固定在手术板上；

2、调整异氟烷浓度至2%，连接面罩并持续吸入。手术期间气体麻醉维持。实验鼠经喉气管插管与小动物呼吸机连接，调整呼吸机呼吸频率、呼吸比与潮气量；

3、术前、术后注意维持实验动物体温(恒温垫控制温度37 ℃)；

4、子宫内移植的手术难度较小，但只适用于从桑椹胚到囊胚期阶段的胚胎。方法是选见阴栓第2.5天或第3.5天的怀孕或假孕雌鼠。背位开一口，在子宫角靠输卵管部位选血管分布少的部位，用4号针扎一小孔，然后用玻璃微管把桑椹胚或囊胚期的胚胎移入。无论何部位的移植‚都应尽量避免带入多余的培养液或气泡；

5、每次移入操作后应将移植管尖端浸入培养液中在解剖镜下检查移植管中有无余留胚胎。若有应再次补移。为确定移入胚胎的分布可在移入后的第 10 天或18.5天打开腹腔检查移植胚胎的植入或分布以及胎儿成活情况。

八、实验成果展示

实验数据分析

总结：相同品系的balb/c鼠的胚胎移植成功率最高，balb/c 鼠与C57鼠的胚胎移植率最低，其中其他基因型鼠的胚胎移植率高可能受到遗传特性的影响

九、实验总结

1、胚胎存放时间：胚胎冲出后，应立即检出和进行胚胎形态鉴定，胚胎在体外或室温下存放时间越短越好；

2、移植针标准：移植针在酒精灯上徒手拉制要求一定要细，不合格的不能用，这样才能在虹吸时不带走多余的液体，以确保胚胎着床率；

3、子宫角定位：在针刺子宫角时，对子宫角的不当固定或过度牵拉，将导致子宫的损伤、瘀血等，影响小鼠受孕；

4、受体的准备：在胚胎移植中，胚胎最终必须移植到合适的受体中才能妊娠，因为受体的生殖、生理状态对妊娠率有很大的影响，因此受体的准备非常重要，要经过严格的筛选，受体的选择要求营养状态和性周期正常，移植时卵巢有红体存在。胚胎检出后，应立即对受体实施麻醉及移植手术，应尽快在短时间内将胚胎移入受体子宫内；

5、无菌操作：在整个手术过程中，一定要注意保持无菌，无论是对供、受体的污染，还是对胚胎的污染，在一定程度上都会对胚胎和妊娠环境有不良刺激，降低胚胎质量和移植妊娠率，从而影响胚胎移植质量；

6、胚胎保存：在捡、洗胚胎的PBS液中，一定要加入适量的新生牛血清，以防止胚胎下沉后与表面皿底部贴壁，捡、洗胚胎完成后，应将其放入37度恒温箱内，同时，还要防止表面皿中液体过少而蒸发干，在体视显微镜下进行捡胚时，速度尽量快，防止因为体视显微镜的灯光很热及长时间的烧烤导致胚胎死亡；

7、移植操作技术：手术中，在往子宫角吹入胚胎时，推压注射器活塞的速度一定要慢，力度要把握适当，以防将空气注入子宫内而影响到移入胚胎在受体鼠子宫内的着床。操作水平的高低会直接影响移植妊娠率，主要包括对胚胎和受体的移植部位的不同技术的操作，熟练的操作者手法轻柔迅速，可以大大缩短操作时间，减少对子宫和胚胎的损伤；

8、调整移植针尖：手术中，如果早注入胚胎时，移植针内的液体不下行，是因为针尖与子宫贴壁造成的，此时科适当将移植针的针尖从子宫角内提起一些，再慢慢推注；

9、移植的胚胎数量：移植的胚胎数量不能太多，如单侧移植每次不能超过10枚，双侧移植不能超过25枚，移植太多对受体不好，甚至导致受体死亡

10、供受体发情同步：供体小鼠的发情与受体小鼠发情的同步性密切相关，是决定胚胎能否移植成功的关键，故受体鼠与结扎公鼠的合笼时间与供体鼠的见栓时间晚12-24小时，同步见栓者，移植效果不佳

11、麻醉：在进行胚胎移植手术时，小鼠的麻醉程度不要太深，手术结束后，8h内要禁食禁水。