细胞ELISPOT检测

服务介绍

随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时以往常用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体。但由于游离的循环抗体或CK的半衰期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。上世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术。

本公司利用特异单克隆抗体捕获细胞受到刺激后局部产生的细胞因子。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合后，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。

服务内容

       1.培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5mL 0.2%戊二醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用PBS洗涤3次，每次3min；

2.抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5mL，4℃过夜，PBS-T洗涤3次，每次3min；

3.制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出脾脏，置于加有Hanks液的小平皿内，用钝头直角9号注射器针头破少许脾被膜后，感触细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取绿叶，1000r/min离心5min，Hanks液洗涤3次，细胞计数后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；

4.往各孔中加入0.5mL含不同浓度(104-106/mL )的细胞悬液，置37℃，5% CO₂条件下孵育2-4h，弃掉培养液，PBS-T洗涤3次，每次3min；

5.往各孔中加入0.5mL生物素化抗体 (Bio-Ab) (2mg/mL)，37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

6.加入辣根过氧化物酶结合的亲和素 (Avi-HRP) (2mg/mL)，37℃孵育30min，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

7.配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mL TMB溶液 (4mg/mL甲醇溶液) 滴加如7.5mL 10%明胶溶液 (用pH5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配置) 边加边搅，溶液呈白色，加入14mL 3% H₂O₂；

8.显示与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6mL明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色斑点。