药物筛选工具系列1-分子互作亲和力检测

亲和力是评价可逆反应过程中两个分子间相互作用强弱的特征参数，是了解分子以及识别生物学过程、药物的发现与筛选等的重要指标。蛋白质相互作用/亲和力检测可应用于药物早期研究开发、筛选鉴定、临床前与临床研究以及下游生产质控等各个环节，而且在生命科学基础研究、生物制药开发等领域也有广泛应用。目前业内常用的检测技术有表面等离振子共振（Surfaceplasmonresonance,SPR）、Biacore分子互作系统、生物膜干涉技术（Bio-LayerInterferometry,BLI）、微量热泳动(MST)系统、等温滴定量热(ITC)系统和圆二色光谱(CD)结构分析系统。

1、LSPR分子互作系统

亲和力是判定分子间相互作用的重要参数，是了解分子以及药物的发现与筛选等的重要指标，除了亲和力之外，还有两个对分子间相互作用评估至关重要的指标（Ka，Kd）。对于药效的评价、生物大分子及其复合体的稳定性的评估需要从动力学、热力学和热稳定性等方面进行包括分子间的结合、结合的快慢、结合的强弱、结合的机理等多方面的全面性研究。

基于LSPR平台为生物医药研发、科研客户提供相应的分子互作分析测试服务，能够实现对蛋白，抗体、抗体片段、多肽、DNA/RNA、纳米材料及小分子化合物等相互作用的定性定量分析，其次也可针对细胞裂解液、核酸文库等依托LSPR-Selex技术垂钓筛选未知靶点。

检测范围：检测范围包括：蛋白-蛋白、抗体-抗原、蛋白-小分子、抗体-多肽、蛋白-DNA、DNA-DNA、蛋白-纳米材料等分子间相互作用力检测；除了蛋白、抗体外，细胞裂解液、细菌等也可结合LSPR-MS质谱等技术鉴定调控蛋白；也可在药物筛选、医疗诊断、环境食品检测、血液标志物检测等领域有广泛应用。

样品要求：
 1配体蛋白（标记芯片）
1.1、纯度大于90%
1.2、浓度大于0.1ug/ul（尽可能高），提供10ug左右。
1.3、需提供配体蛋白的等电点
1.4、配体蛋白缓冲液尽量避免Tris等带有氨基基团的试剂
1.5、避免颗粒或絮状沉淀
2、分析物（流动相）
2.1、纯度大于80%
2.2、浓度大于0.1ug/ul（尽可能高），提供冻干粉最好。根据样本情况，提供10-100ug左右。
2.3、提供准确分子量和浓度以及溶剂成分
2.4、溶剂最好不能含有有机化合物，如：DMSO甘油。如果一定需要加入有机溶剂，就尽量提供高浓度的分析物，通过稀释可以降低其含量比。
2.5、尽可能不含有海藻糖，BSA，蔗糖等保护剂。如果一定需要加入，需提供准确的浓度，以及尽可能提供高浓度含分析物原液，以便通过稀释降低其含量比，稀释后上样终浓度中抗原抗体保护剂浓度≦0.01%既可。

2、Biacore分子互作系统

Biacore的检测原理基于表面等离子共振技术（SPR），能够灵敏地反映距离传感芯片表面约150nm范围内折光率的变化。为了研究两个分子之间的相互作用，其中一个分子被固定到芯片表面上，而另一个分子以溶液的形式连续流过表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化。SPR响应值直接与芯片表面附近的质量浓度变化成正比。

BIAcore系统可以为很多领域提供有价值的信息包括：动力学、亲和力、特异性、热力学和浓度等。Biacore系统原则上可以用于研究任何种类分子间的相互作用：从候选的有机药物分子到蛋白质、核酸、糖、甚至是病毒和全细胞。因为响应值与质量浓度成正比，因此每摩尔浓度的结合分子产生的信号与其分子量成正比（较小的分子量产生较低的响应值）。现在分子量的实际检测下限约为100Da（注：BiacoreT200对有机分子无分子量下限）。

Biacore的检测原理不需要对任何样品分子进行标记，既可以测定纯化的样品，也可以对复杂的混合物进行分析，比如细胞培养液上清，细胞裂解液。混合样品的结合过程受样品中结合反应物与固定在芯片表面的分子结合的特异性决定。SPR检测技术无需改变分子性质，而且可检测澄清、有色或不透明的样品。

3、BLI生物膜干涉系统

ForteBio Octet分子相互作用分析系统是一种非标记的、实时监测的先进技术，主要用于生物分子间相互作用的全方位定量分析以及蛋白浓度测定。该平台通过浸试即读的检测方式（DipandRead），可轻松处理未经纯化的样品，从而研究真实生物环境中样品分子的相互作用和结合动力学，这类样品通常无法在基于SPR的平台上运行。如：分析未经过滤的细胞培养上清和裂解液；研究生物环境中分子之间相互作用；直接的病毒或病毒样颗粒样品亲和力分析。

检测原理 —生物膜干涉技术（Bio-LayerInterferometry，BLI）

生物膜干涉技术采用探针式生物传感器对样品直接进行检测，对检测样品无需做任何荧光或同位素标记。通过仪器发射白光到传感器表面并收集反射光，不同频率的反射光谱受到生物传感器的光膜层厚度的影响并形成干涉。因此，结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移可直接反映出传感器表面生物膜的厚度及密度变化，从而对待测分子间的相互作用过程进行精确的定量测定。

4、微量热泳动(MST)系统

提供MonolithNT.115微泳动量热生物分子相互作用检测服务项目。微量热泳动（MicroScaleThermophoresis，MST）是一种定量分析生物分子间相互作用的前沿技术，通过精确检测荧光变化，结合灵敏的热泳动现象，MST提供了一种灵活、强大和快速测量分子间相互作用的方法。MST测试时，由红外激光建立微观温度梯度场，通过荧光染料标记、荧光融合蛋白、色氨酸自发荧光等信号追踪，分子在微观温度梯度场中的定向移动就可以被探测和量化。MST在缓冲液中操作，无需任何表面固定，因此即使对于体积较大、不稳定的样品，比如脂质体、纳米材料或者膜蛋白，也同样适用。MST将荧光检测的精准性与热泳动的灵活性及灵敏度结合起来，快速、可信地检测分子间相互作用。MST可用于检测小分子之间、蛋白和蛋白之间、多蛋白复合物之间的相互作用，应用范围广泛。

5、等温滴定量热(ITC)系统

等温滴定量热系统提供MonolithNT.115微泳动量热生物分子相互作用检测服务项目。微量热泳动（MicroScaleThermophoresis，MST），通过精确检测荧光变化，结合灵敏的热泳动现象，MST提供了一种灵活、强大和快速测量分子间相互作用的方法。

等温滴定量热法(ITC)是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术，可以测定结合配偶体在自然状态下的亲和力，无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰。通过测量结合过程中的热传递，就能够准确地确定结合常数(KD)、反应化学量(n)、焓(∆H)和熵(ΔS)。这就提供了有关分子相互作用的完整热力学信息。ITC不仅可测定结合亲和力，还能阐明潜在分子相互作用的机制。

测量原理：
等温滴定量热法用来测定各生物分子之间的反应。该方法可测定结合亲和力、化学计量以及溶液中结合反应的熵和焓，无需使用标记。

工作原理：
热核心：微量热计中有两个池，其中一个含有水，作为参比池，另一个含有样品。微量热计必须使这两个池保持完全相同的温度。热敏装置检测发生结合时两个池之间的温差，并反馈给加热器，由加热器来补偿该温差并使两个池恢复到相同的温度。

进行测量：参比池和样品池被设定到所需的实验温度。将配体装入一个非常精确的注射装置上的注射器中。将注射装置插入包含目标蛋白质的样品池中。将一系列小份配体试样注入到蛋白质溶液中。如果有配体与蛋白质结合，则可检测到并测出几百万分之一摄氏度的热量变化。进行第一次注射时，微量热计测量被释放的所有热量，直到结合反应达到平衡。测得的热量与结合量成正比。

结果和数据分析：

示例中，反应是放热的，意味着样品池温度高于参比池并由此导致信号出现下行波峰。随着两个池的温度恢复到同一水平，信号也回到其起点。将第二小份配体试样注入到样品池中，同样，微量热计补偿所检测到小幅热量变化。配体与蛋白质之间的摩尔比随着一系列配体试样的注入而逐渐增加。蛋白质越来越饱和，配体结合的次数越来越少，并且热量变化开始减小，直到样品池中的配体数量相对于蛋白质而言最终表现出过量为止，从而使反应朝饱和的方向进行。

然后对每个峰的面积进行积分，并以配体与蛋白质的摩尔比作为横坐标进行绘图。由此得出的等温线可拟合至导出亲和力(KD)的结合模型。结合等温线中心的摩尔比即为反应化学计量。下图给出了1:1结合反应的示例图。

焓(ΔH)也可通过等温线直接导出，它表示每摩尔结合配体所释放的热量。这就意味着一次ITC实验就可提供丰富的结合反应信息，有助于理解相互作用的性质并探索热力学驱动因素。

6、圆二色光谱(CD)结构分析系统

利用蛋白质的圆二色性及不对称分子对左右圆偏振光吸收的不同来进行结构分析。圆二色谱在远紫外区的扫描图谱，反映的是蛋白质肽键的排布信息，计算所得的是蛋白质二级结构比例，即α-螺旋、β旋折叠、转角和不规则卷曲的比例；圆二色谱在近紫外区的扫描图谱，反映的是蛋白质侧链生色基团色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等残基的排布信息和二硫键微环境的变化。

基本流程：

客户提供：

提供样品:

远紫外：浓度＞0.5mg/ml，样本量＞200μg，纯度＞90%；
近紫外：浓度＞5mg/ml，样本量＞2mg，纯度＞90%；
不要添加任何保护剂或其他物质（透明性极好的磷酸盐可用作缓冲体系）

提供信息：
样品制备方法及缓冲液信息、纯度检测方法及结果图谱数据；
样品如被修饰，请详细告知修饰方法。