小鼠玻璃体注射

简述眼球结构：

眼是一个可以感知光线的器官。眼睛通过把光投射到对光敏感的视网膜成像，在那里，光线被接受并转化成信号并通过视神经传递到脑部。通常眼睛是球状的，当中充满透明的凝胶状的物质，有一个聚焦用的晶状体，通常还有一个可以控制进入眼睛光线多少的虹膜。眼球壁主要分为外、中、内三层。

外层是纤维膜，由角膜、巩膜组成。角膜含丰富的神经，感觉敏锐。角膜除了是光线进入眼内和折射成像的主要结构外，也起保护作用，并是测定人体知觉的重要部位。巩膜为致密的胶原纤维结构，不透明，呈乳白色，质地坚韧。

中层又称葡萄膜，色素膜，具有丰富的色素和血管，包括虹膜、睫状体和脉络膜三部分。

内层为视网膜，是一层透明的膜，也是视觉形成的神经信息传递的第一站，具有很精细的网络结构及丰富的代谢和生理功能。

眼内腔：包括前房、后房和玻璃体腔。眼内容物包括房水、晶体和玻璃体。三者均透明的，与角膜一起共称为屈光介质。玻璃体有屈光作用，也起支撑视网膜的作用。

 （小鼠眼球结构，插图来源：中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究）

眼球注射作用：

小鼠眼球结构（图片来源：网络搜集）

眼球作为相对独立的器官，球内注射是最有效的药物递送方式。眼球注射可突破血眼屏障,使药物迅速浓集于眼内, 继而在眼内扩散到达作用部位。

具有代表性的眼内注射给药途径有视网膜下(subretinal)注射和玻璃体腔(Intravitreal)注射，玻璃体内注射能够使基因药物可以较快扩散至视网膜或脉络膜部位，如临床上常用于老年性黄斑变性的药物输送；视网膜下注射可将药物直接传递到视网膜和视网膜色素上皮细胞(RPE)之间的潜在空间，是将药物直接递送至RPE细胞的最佳方法。

实验步骤：

实验器械及耗材：吸入式麻醉机、Hamilton注射器(30G、33G)、托品酰胺、去氧肾上腺素、手术显微镜

实验大体分为：麻醉-扩瞳-预切口-注射

麻醉：

1. 小鼠置于诱导盒内进行吸入式异氟烷麻醉，捏合小鼠脚指确认是否麻醉完全;

2. 将老鼠转移到解剖显微镜下，连接鼻锥持续给予异氟烷;

3. 待注射眼睛滴加一滴丙美卡因(或类似的表面麻醉剂)防止注射引起局部反射，轻触结膜确定麻醉深度；

扩瞳:

1. 倾斜鼠标头部，使待注射眼睛在视野范围内，用棉签擦去任何多余的液体；

2. 向待注射眼球滴加1-2滴1%托品酰胺和0.5%去氧肾上腺素用于扩大瞳孔；

巩膜切口（预切口）:

1. 使用镊子在上下眼睑之间滑动，使眼球从眼窝中伸出，暴露巩膜;

2. 采用30G针头在角巩膜缘后面做一个小的巩膜预切口(推荐小鼠可以用 ALCON 的 10-0 针做切口，非常整齐，33 G 的针进去水密非常好;也可以用破囊针;切口越整齐，与针越匹配，越不易渗漏)；

注射：

1. 用镊子捏紧缘下约1mm处的结膜保持眼球稳定；

2. 将装好注射液的33G注射针头，相对视神经约60度角，从角巩膜缘后预切口，插入约1mm进行玻璃体腔注射；操作注射器平稳注入适量液体，注意注射过程避免晃动引起额外的组织损伤；注射后停留针头约30秒以防漏液，然后将针头慢慢抽出，重新放置结膜，轻轻将眼睛放回眼窝，闭上眼睑；如果需要双侧眼球注射，将另一面眼球转到显微镜视野下重复上述步骤，注射后可在角膜和注射区域涂抹抗生素眼药膏防止感染

注射示例（图片来源：网络搜集）

 图注：注射前(左一)与注射后(右一)

注意事项：

眼球注射过程应确保动物眼睛一直湿润，避免角膜干燥，可根据需要多次使用润滑滴眼液；

注射过程应缓慢进行，避免速度过快造成液体从注射部位回流；

眼球注射前应充分扩瞳，建议双眼散瞳，以防一眼出现意外时可以迅速换眼；瞳孔过小不易看清眼底，会降低注射成功率，同时瞳孔过小也是虹膜出血的主要原因；

角膜穿刺点靠近角巩缘处为好，以免形成角膜白斑而影响后续动物实验；

注射时针尖应垂直进入，随后倾斜；小鼠眼球小且晶体球形，倾斜角度小会损伤晶体，大会扎上视网膜导致出血；需要注意晶状体占据玻璃体腔的大部分，应小心避免刺穿晶状体；

推注液体时应当控制速度，迅速推注取材时会发现视网膜散在出血点，可能干扰试验结果；推针以后留针 0.5-1 min，迅速出针；

注射结束后需要检查，若术中损伤视网膜血管会立刻出血，此刻建议剔除；术后若晶体变全白，2-3 h 后会全部恢复；若晶体损伤可在术中发现，术后会逐渐出现局限的混浊。

参考文献：

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