1、状态良好、无污染的细胞（实验结果可靠的前提）

2、4% 多聚甲醛（PFA）固定液（室温处理，避免冷处理细胞，导致细胞皱缩）

3、0.1%-0.5% Triton X-100（透化剂）

4、PBS（磷酸盐缓冲液）及PBST（磷酸盐缓冲液+ Tween-20）

5、封闭液（1%-5% BSA，阻断非特异性结合）

6、一抗（针对目标蛋白的特异性抗体，优先选择单克隆抗体，避免非特异性）

7、荧光标记的二抗（如 Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594等）

8、DAPI 或 Hoechst（细胞核染色剂）

9、抗荧光淬灭封片剂

1、细胞准备

◆ 将细胞接种在含爬片的培养板中，培养至 70% 融合度。（也可用玻璃培养皿进行样品制备；（尽量避免使用塑料培养器皿进行样品制备，而导致成像扭曲、像差和背景杂光，无法获得高分辨率、高清晰度的图像）。

2、清洗及固定（防止目标蛋白在后续步骤中扩散、流失或降解）

◆ 去除培养基，沿器皿侧壁加入PBS润洗细胞2-3次，请勿用PBS直冲细胞，以免造成细胞脱落；

◆ 加入 4% PFA 固定液，室温固定 10-20 分钟；

◆ 固定好的样片用PBS清洗3次，每次5分钟。

3、通透（抗体能够进入细胞内部）

◆ 用 0.1%-0.5% TritonX-100 溶液透化细胞，室温孵育 10 分钟。通透时间通常为5 ~ 20 min‌。（该步骤可选；通透步骤会破坏细胞膜，细胞膜表面抗原不适合选择通透实验）。

◆ 通透后的样本用PBS清洗3次，每次5分钟；

4、封闭（减少一抗/二抗与非特异性抗原位点的结合，减少背景染色）

◆ 加入1%-5% 的 BSA（牛血清白蛋白）溶液，室温孵育 60 分钟；

◆ 封闭结束可直接孵育一抗，无需再用PBS洗涤，目的是维持封闭环境，防止非特异性结合位点重新暴露。

5、一抗孵育（识别目的蛋白）

◆ 弃封闭液，加入含1% BSA的PBS配制的一抗，24孔板每孔可加入200-250ul，室温孵育2h，或4℃保湿过夜孵育；

◆ 孵育结束后，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

注：孵育的一抗可以重复利用，收集到干净的离心管，低温避光保存即可。

6、荧光二抗孵育（识别一抗，二抗上带有荧光团用于后续的荧光显微镜观察）

◆ 采用抗体工作液稀释荧光标记的二抗，细胞加入二抗溶液，室温避光孵育1小时；

◆ 孵育后，用PBST(0.1%Tween)清洗样片，清洗3次，每次5分钟；（PBST是使用可以更好的去除未结合的二抗，可以降低背景信号）。

7、细胞核染色（为目的蛋白做定位参照及反应细胞状态）

◆ 10ml PBS加入1ul DPAI原液，室温孵育 5-10 分钟，避光操作；

◆ 用 PBS 再次洗涤 2-3 次，每次 5 分钟。

8、封片（防止荧光淬灭）

◆ 在载玻片上滴加适量封片剂，采用弯头尖镊将细胞爬片倒扣在载玻片上，使细胞接触到封片剂；

◆ 小心覆盖盖玻片，避免形成气泡；

◆ 封片后，样本可以在避光低温条件下保存，建议尽快进行显微镜观察。

9、荧光显微镜观察（目的蛋白可视化）

◆根据不同的荧光染料，选择不同波段的激发光，DAPI为蓝色，488通道为绿色。

注意事项

◆ 信号弱或无：一抗失效/稀释过度；固定过度（PFA固定时间太长）；通透不足；二抗不匹配（一抗是鼠源，二抗则需要是抗鼠的）。

◆ 背景太高：封闭不充分；一抗浓度过高或非特异性结合；洗涤不彻底；二抗浓度过高；样本干燥等。

◆ 非特异性斑点：固定时产生沉淀；抗体聚集（使用前离心）；细胞状态差，有死细胞。

◆ 定位不对：固定不当导致抗原移位（膜蛋白不需要固定步骤）；错误使用甲醇固定膜蛋白。

◆ 荧光淬灭快：未使用防淬灭封片剂；曝光时间过长；封片时有气泡。