作为丝氨酸蛋白酶家族的代表，胰蛋白酶凭借对赖氨酸、精氨酸肽键的切割能力，成为贴壁细胞传代的经典之选。它通过水解细胞表面黏附蛋白（如层粘连蛋白）瓦解细胞间连接，搭配 EDTA 螯合钙镁离子，可显著提升消化效率。

注意事项
⚠️ 消化时间需严格把控，避免细胞膜功能蛋白损伤
⚠️ 消化过程呈现 “从贴壁到悬浮” 的典型变化（见图 1-3）

*0.25%胰酶-0.02% EDTA消化HuH-7(人肝癌细胞），消化前中后的照片。

图1：消化前（细胞贴壁，紧紧挨着）

图2：消化中（可以看到类似藕断丝连的现象）

图3：消化后（细胞脱落，漂浮，聚团）

        源自溶组织梭状芽孢杆菌的胶原酶，是破解结缔组织的 “专业选手”。它靶向水解胶原蛋白肽键，对细胞损伤极小，尤其适合纤维性组织、上皮及癌组织的分离。根据组织硬度差异，胶原酶分为多种类型：

 应用举例：不同酶消化法提取猪原代肝细胞的效果比较（南京大学）

周徐倩，董磊*

（南京大学，江苏 南京 210023）

不同酶消化法提取猪原代肝细胞的效果比较[J]．现代畜牧科技，2024，107（4）：53-55．　doi：10.19369/j.cnki.2095-9737.2024.04.014．

        上述文献采用离体酶消化法，比较胰蛋白酶、II型胶原酶、IV型胶原酶、II型和IV型胶原酶混合物提取猪原代肝细胞的效果。结果显示，这4种酶消化法均能获得有功能的肝细胞，其中胶原酶混合物分离的肝细胞数量最多，胰蛋白酶法分离的肝细胞数量较少，II型、IV型胶原酶消化法分离的肝细胞排列整齐、边界清晰。

        需要注意的是，无论使用何种酶消化，均需要精细地控制酶的用量、消化时间和温度，避免因消化不充分或过度消化影响细胞的得率和活性。

        这款由蛋白酶、胶原酶等组成的混合酶液，堪称细胞消化界的 “多面手”。其温和特性尤其适合干细胞、原代细胞及表面标志物检测场景，无需血清中和即可直接离心，大幅简化操作流程。

   使用注意：不要在温水浴中解冻本品。

    Accutase对37 °C以上温度敏感，在37 °C下45分钟后会失活。建议放在冰箱中过夜解冻，或放在一盆冷的自来水中解冻1-1.5小时。

    Accutase解冻后，摇动瓶子使溶液混匀。本品无需在使用前加热。从冰箱中取出后应立即使用，用完后放回冰箱。 Accutase融化后4℃保存，至少2个月稳定。不可室温保存。也可分装成单次用量，放到-80 ℃冻存，有效期2年。

流式检测数据显示：凋亡率显著低于传统胰酶（见上图）。

   截图文献：Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ ＰＩ 法流式细胞术检测细胞凋亡的影响因素. ＤＯＩ：１０． １６５１９／ ｊ． ｃｎｋｉ． １００４⁃３１１ｘ． ２０２２． ０６． ０１１２

        上述细胞凋亡流式检测图可以看到：对于未处理细胞而言，与无EDTA 胰酶相比，Accutase能显著减少凋亡率(２.70％ ｖｓ 18.05％）；而经药物处理的细胞，Accutase组凋亡率也有一定程度减少（22.32％ ｖｓ26.50％），但差异没有未处理细胞大。但都可以看出使用Acuutase处理需要流式检测的细胞，优势是很明显的。

        细胞培养中常用的消化酶还有中性蛋白酶，分散酶，透明质酸酶等多种，在此就不再一一展开介绍了。下面总结一下常用消化酶的选择依据：

1. 细胞类型：

- 常规传代细胞：胰蛋白酶。

- 原代细胞或干细胞：胶原酶、Accutase。

2. 组织硬度：

-坚硬组织（肿瘤、肝脏）：Ⅰ型胶原酶。

-柔软组织（脑、胚胎）：分散酶。

3. 实验需求：

-需保留表面标志物：分散酶或Accutase。

-快速消化：胰酶+EDTA。