自噬整体解决方案

    细胞自噬(autophagy or autophagocytosis)：又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg) 的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。自噬作为时下的研究热点，有非常深远的研究意义。拓普生物在自噬研究方面具有丰富的经验，我们可以为您提供从课题设计-实验操作-实验结果-数据分析的整体解决方案。

自噬诱导剂
1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激；
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）；
3）Earle's 平衡盐溶液：制造饥饿；
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway 抑制剂；
5）Rapamycin：mTOR 抑制剂（这是最常用的）；
6）Xestospongin B/C：IP3R 阻滞剂。

自噬抑制剂

1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂；
2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂；
3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）。

细胞自噬形态学特征的检测方法

1）透射电镜观察自噬体。

    自噬体是自噬的标志性结构。自噬体属于亚细胞结构，直径一般为300～900nm，平均500nm，普通光镜下看不到。通过透射电子显微镜发现自噬体一直是观察自噬现象最直接、最经典的方法，是自噬检测的“金标准”。

2）荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成。

    由于自噬体膜形成过程中需要LC3，因此通过标记LC3可以识别自噬体。

3）荧光染色法

    用荧光染料对组织切片或细胞进行染色观察自噬的发生。晚期自噬体与溶酶体融合而呈酸性，根据这个特点可用酸向性染料MDC、吖啶橙和Lyso Tracker标记自噬溶酶体。

自噬标志性蛋白
1）自噬标记蛋白LC3

    微管相关蛋白1轻链3(LC3／Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内存在两种形式的LC3蛋白，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。细胞内新合成的LC3其C端被Atg4蛋白酶剪切，成为胞质可溶形式的LC3-Ⅰ。当自噬体形成后，LC3-Ⅰ经剪切和泛素化加工修饰。与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)偶联，成为膜结合形式的LC3-Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜,因此LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可以估计自噬水平的高低。

2）细胞自噬底物蛋白的检测

         p62偶联于LC3，作为一种调节因子参与自噬体的构成，在自噬的中、晚期被降解。细胞内整体p62水平的表达与自噬活性存在负相关。蛋白质免疫印迹技术检测p62水平的降低可以反映自噬活性程度。p62的增加暗示着自噬、溶酶体降解途径被抑制。

3）Atg12-Atg5复合体 

    除了LC3，自噬体膜上标志性蛋白质还有Atg12-Atg5结合体。Atg12和Atg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。

4）Beclin1 

    哺乳动物Beclin1是酵母Atg6基因的同源物。Beclin1通过激活自噬对细胞生长和抑瘤机制进行控制。蛋白质印迹技术检测Beclin1蛋白表达情况直接反映自噬活性。

5）自噬相关的标志性蛋白还包括ATG1、ATG9、DRAM1、ATG14、ATG16以及 ATG18等。

自噬的调控通路

1）依赖mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）途径的自噬

A．PI3K-AKT-mTOR信号通路

         B. AMPK-TSC 1/2-mTOR 信号通路

2）其它的信号通路

A. 3-甲基腺嘌呤（3-MA）通过抑制Class ⅢPI3K的活性抑制自噬；

 B. beclin1和UVRAG作为正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与组成ClassⅢPI3 复合物调控自噬；

C. GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬；

D. 死亡相关蛋白激酶（death-associated proteinlinase,DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）诱导自噬。