【拓普课堂】人骨髓间充质干细胞(hMSCs)之分离培养方法

1  什么是骨髓间充质干细胞(hMSCs)

      常见干细胞制剂主要分为成体干细胞、胚胎干细胞及诱导的多功能干细胞（ipsc）三类。今天小编要跟大家介绍的是骨髓间充质干细胞（hMSCs）：骨髓间充质干细胞是一种具有多分化潜能的成体干细胞，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种能在体外或体内具有分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的多种分化潜能的细胞亚群，据相关报道称骨髓间充质干细胞能分化成心肌、骨骼肌、神经细胞、造血干细胞、肌腱、肝组织、肾组织和连接组织。它们对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。

2 hMSCs细胞身份证

3  hMSCs细胞来源
       1999年，Pittenger等首先用单细胞培养的方法获得了人骨髓基质细胞集落，又将这些来自一个克隆的细胞分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。该细胞的分化实验证明了骨髓基质中确实存在具有多向分化能力的干细胞。这些成纤维样细胞被称之为间充质干细胞。近年来科学家们还发现除骨髓以外，间充质干细胞广泛存在于脂肪、皮肤、胎盘、胸腺、滑膜、骨膜、牙髓、骨胳肌、外周血、脐带血、胚胎肝脏、脑、胰腺、脾、肾等组织中。

4 hMSCs分离方法

       目前常用的分离hMSCs的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞在低血清培养基中有贴壁优势特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化及扩增MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中各细胞成分比重的不同，分离单核细胞进行贴壁培养。二者本质上无多大区别。随着对MSC表面抗原认识的深入，又有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化。但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之成本较高和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

      现以密度梯度离心法介绍hMSCs的分离培养方法：

(1) 无菌条件下抽取骨髓液5mL，用等体积PBS稀释混匀，室温下1500rpm离心10分钟；

(2) 弃去脂肪层，将稀释骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积Ficoll分离液（1.077g/mL）上面，室温2500rpm离心30分钟；

(3) 吸取界面白膜状层的单个核细胞，用PBS混悬后，室温1500rpm离心10分钟；

(4) 弃上清并重复洗涤2次。

(5) 用含10%FBS的LG—DMEM培养液（或骨髓间充质干细胞专用培养基）重悬细胞，调整细胞密度为2x105/mL，接种于底面积为25cm2培养瓶中置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养；

(6) 于3天后首次换液，弃去悬浮细胞后，每2-3天换液一次；

(7) 每日镜下观察细胞形态及生长变化，待细胞生长达80%-90%融合时，用胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%:0.02%）进行消化，按1：2比例进行传代培养。

图一 分离第8d

图二 分离第10d

图二 分离第15d